La quantification précise de protéines est essentielle à toute expérience liée aux protéines dans une multitude de projets de recherche en biologie moléculaire, biologie cellulaire, biochimie, biologie développementale et neuroscience.

Durant le dernier siècle, différentes méthodes ont été développées pour mesurer les protéines: pour une expérience précise, pour déterminer le contenu en protéines totales et pour mesurer une protéine particulière.

Les méthodes de quantification des protéines totales comprennent des méthodes traditionnelles telles que la mesure d’absorbance a 280nm, la méthode utilisant l’acide Bicinchoninic (BCA) et la méthode de Bradford, de même que les méthodes alternatives telles que la méthode de Lowry ou de nouvelles techniques développées par les différentes compagnies distributrices. Généralement les distributeurs fournissent des kits très bien conçus pour chaque type de méthode. La quantification de protéine individuelle comprend des méthodes telles que l’ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), l’analyse en western blot, et plus récemment la spectrophotométrie de masse.

Dans cette revue, quelques-unes des méthodes communément utilisées pour déterminer la concentration de protéines sont présentées, leur utilité et leurs limites sont plus particulièrement discutées. Il est important de noter qu’aucune de ces méthodes de quantification de protéines est soit spécifique aux protéines, ce qui signifie que des composants non protéiques peuvent interférer, ou soit uniformément précise et compatible avec toutes protéines.

La règlementation ou les lois d’agences gouvernementales ou de groupes commerciaux peut exiger l’utilisation de méthodes spécifique pour la quantification de protéines totales. Par exemple, l’International Serum Industry Association (www.serumindustry.org), un groupe commercial pour les fournisseurs de sérum exige l’utilisation de la méthode au Biuret pour la détermination du contenu protéique des produits sériques.

La table I résume l’ensemble des méthodes de mesure des protéines totales communément utilisées. Il est important pour les chercheurs d’évaluer la compatibilité de chaque méthode avec le type d‘échantillon étudié, les limites de dosage, le volume d’échantillons et la disponibilité d’un spectrophotomètre approprié, de même que le temps et le coût requis pour chaque méthode.

Les acides aminés aromatiques tyrosine et tryptophane donnent aux protéines la capacité d’absorber dans l’ultraviolet à 280 nm, qui est généralement utilisée pour estimer la concentration en protéines. La phénylalanine et les ponts disulfures contribuent également à l’absorption à cette longueur d’ondes, bien que faiblement. Cette méthode est simple et ne requiert qu’un très petit volume d’échantillons car les nouveaux spectrophotomètres utilisent un système de rétention de l’échantillon durant la mesure. Cependant, l’échantillon de protéines doit être pur et ne doit pas contenir de composants non protéiques présentant le même spectre d’absorbance, tels que les contaminations par les acides nucléiques [1]. Cette méthode est la plus rapide mais sujette à l’erreur.

La méthode à l’acide bicinchoninic (BCA) a été inventée par Paul K. Smith en 1985 chez Pierce Chemical Company, le distributeur majeur de ce kit [2, 3]. La méthode au BCA et la méthode de Lowry sont toutes les deux basées sur la conversion de Cu2+ en Cu1+ sous des conditions alcalines. Cette conversion est définie comme la réaction de Biuret. Cette réaction est influencée par 4 acides aminés (cystéine, cystine, tyrosine, et tryptophane) et aussi par la structure peptidique.

[agrandir]

Figure 1. Représentation schématique de la méthode au BCA.

BCA est un réactif chromogène spécifique de Cu1+ et dans la deuxième étape de la réaction deux molécules de BCA réagissent avec un ion Cu1+. La quantité de Cu2+ réduite est proportionnelle à la concentration en protéines qui peut être déterminée à l’aide d’un spectrophotomètre par changement de la couleur de l’échantillon en violet, qui absorbe à 562 nm. L’absorbance est directement proportionnelle à la quantité de protéines présentes dans la solution et peut être estimée par comparaison avec une protéine standard telle que l’albumine bovine sérique (BSA) [1, 4, 5].

La méthode au BCA est plus tolérante à une gamme de détergents ioniques et non-ioniques tels que NP-40, Triton X-100 et aux agents dénaturants tels que l’urée et le chlorure de guanidinium, qui ont tendance à interférer avec d’autres méthodes de quantification de protéines colorimétriques telles que la méthode de Lowry (Table 2) [5]. Certaines molécules chimiques telles que les sucres réducteurs peuvent interférer avec la méthode au BCA. Les effets de ces interférences peuvent être éliminés ou réduits via plusieurs stratégies comme l’élimination des substances interférentes par dialyse, filtration par gel ou si la concentration en protéines est élevée par dilution de l’échantillon.

Thermo Fisher Pierce a récemment introduit une nouvelle version du kit Pierce BCA classique compatible avec les agents réducteurs tels que le dithiothreitol (DTT), le 2-merceptoethanol (BME), le TCEP et autres agents réducteurs de ponts disulfures [2, 3].

En comparaison avec les autres méthodes, la méthode du BCA est la plus sensible (elle permet de détecter les protéines à des concentrations aussi faible que 5 ug/ml), Elle présente également moins de variabilité que les autres (i.e., Méthode de Bradford), et peut être utilisée pour mesurer une vaste gamme de concentrations de protéines.

La méthode de Bradford, a initialement été décrite par Dr. Marion Bradford en 1976 et est une des méthodes les plus populaires pour déterminer la concentration de protéines. Elle dépend de la formation d’un complexe entre le bleu de Coomassie G-250 et les protéines en solution. Le colorant existe sous quatre formes ioniques. La forme la plus anionique bleue se lie aux protéines et présente une absorbance à 590 nm. La concentration de protéines peut être évaluée en mesurant la quantité de la forme bleue ionique du colorant et en mesurant l’absorbance de la solution à 595 nm à l’aide d’un spectrophotomètre [6]. Le colorant se lie surtout aux résidus arginine, tryptophane, tyrosine, histidine, et phénylalanine des protéines [1].

[agrandir]

Figure 2. Représentation schématique de la méthode de Bradford.

La plus part des chercheurs utilisent la BSA comme protéine standard car elle est peu couteuse et facilement disponible mais n’est pas toujours adaptée. En effet, un désavantage de l’utilisation de la BSA est qu’elle présente une forte réponse au colorant qui peut entrainer une sous-estimation de la quantité de protéines. L’immunoglobuline G (IgG) ou le lysozyme, ou d’autres protéines standards devraient être choisies en fonction du type d’échantillon de protéines [6].

Un avantage de cette méthode est sa compatibilité avec les agents réducteurs utilisés pour stabiliser les protéines en solutions, qui ne sont pas compatible avec la méthode de Lowry et avec la méthode au BCA. La restriction de la méthode de Bradford est son incompatibilité avec les faibles concentrations de détergents qui sont systématiquement utilisés pour solubiliser les protéines membranaires. Cependant, les substances détergentes peuvent être éliminées par filtration sur gel, dialyse, ou précipitation des protéines au phosphate de calcium [6]. Un autre avantage est la possibilité de mesurer des protéines de haut poids moléculaire (MW) car le colorant ne se lie pas aux peptides de bas poids moléculaire [1, 6]. Cependant, les niveaux très faibles de détergents non-ioniques tels que le Triton X-100 a la concentration finale de 0.008% (v/v), peuvent améliorer la sensibilité et la variabilité de la méthode de Bradford [7].

La méthode de Lowry, propose par Oliver H. Lowry en 1951, est basée sur deux réactions chimiques. La première réaction est la réduction des ions de cuivre sous conditions alcalines, qui forment un complexe avec les peptides ou protéines (réaction du Biuret). La seconde est la réduction du réactif de Folin-Ciocalteu par le complexe cuivre- peptide qui, par la suite, induit un changement de couleur de la solution en bleu avec une absorbance entre 650 et 750 nm détectable avec un spectrophotomètre [1]. La quantité de protéine dans l’échantillon peut être estimée en utilisant une gamme étalon d’une protéine standard choisie telle que la BSA.

[agrandir]

Figure 3. Représentation schématique de la méthode de Lowry.

Les avantages de cette méthode sont sa sensibilité et surtout, sa précision. Cependant, cette méthode demande plus de temps que les autres techniques et beaucoup de composés essentiellement utilisés dans les solutions de préparation de protéines (tel que, détergents, carbohydrates, glycérol, Tricine, EDTA, Tris) interfèrent avec la méthode de Lowry et forment des précipités (Table 3) [1]. Néanmoins, l’effet de ces substances peut être réduit par dilution de l’échantillon mais seulement si la concentration de protéines est suffisamment élevée [8]. De plus, Il a été montré que le temps nécessaire à la réalisation de cette technique peut être réduit en augmentant les températures ou par l’utilisation d’un four micro-onde [8].

Une étape cruciale de beaucoup d’expériences est la quantification d’une protéine spécifique en solution. Pour ce faire, plusieurs techniques ont été utilisées. Les plus communes sont l’ELISA, l’analyse en western blot, et la spectrométrie de masse. L’ELISA et le Western blot sont décrits dans l’article sur les applications des anticorps, La spectrométrie de masse est brièvement décrite ci-dessous.

La spectrométrie de masse de protéines est une méthode émergeante pour la quantification de protéines. Au-delà de la caractérisation de protéine, une étape importante en analyse protéomique est la possibilité de quantifier une protéine spécifique. Plusieurs techniques ont été introduites et appliquées pour la quantification de protéines par spectrométrie de masse. Normalement, des isotopes lourds et stables de carbone (13C) ou d’azote (15N) sont ajoutés à un échantillon (peptides ou protéines) alors que les isotopes légers correspondants (12C and 14N) sont ajoutés à un second échantillon (standard interne). L’échantillon et le standard interne sont mélangés pour l’analyse. Du fait de la différence de masse entre l’échantillon et le standard interne , il est possible d’analyser le ratio des piques d’intensités des deux molécules par un analyseur de masse. Ce ratio correspond au ratio de quantité relative de l’échantillon par rapport au standard interne. Une seconde méthode permet la quantification des protéines par spectrométrie de masse sans marquage des échantillons (i.e., avec « matrix assisted laser desorption/ionization » – analyse MALDI). Ici, il est important de souligner qu’une approche universelle telle que la spectrométrie de masse peut être utilisée pour réaliser une analyse quantitative et qualitative simultanément. Néanmoins, cette méthode requiert des instruments que tout laboratoire ne peut se permettre d’acquérir et ceci limite l’utilité de cette approche [4, 9].

Labome a revu plus de 100 publications citant les méthodes de quantification de protéines. Thermo Fisher Pierce et les laboratoires Bio-Rad représentent les fournisseurs majeurs de kits de quantification de protéines totales (Table 4). Les méthodes les plus communément utilisées sont les méthodes au BCA et de Bradford.

Presque tous les kits pour la méthode au BCA cités dans la littérature ont été fournis par Pierce, ou un des scientifiques a inventé la méthode. Il y a quelques années, Thermo Fisher a acquis Pierce. Les kits BCA de Thermo Fisher Pierce ont été utilisés pour étudier la carcinogenèse thyroïdienne [10], le rôle de VLDLR dans la division cellulaire [11], les modifications post traductionnelles de S100A4 [12], les protéines hnRNP H et hnRNP F comme inhibiteurs du récepteur 2 du facteur de croissance des fibroblastes g [13], le mécanisme soutenant l’augmentation des activités de StAR et de l’aromatase dans l’endométriose [14], l’effet de l’héparanase sur l’adhésion et la propagation cellulaire [15], la régulation et le rôle de l’expression de NAG-1 expression dans les cellules de carcinome prostatique humain PC-3 traitées par VES [16], le rôle de l’IGF-1R dans la fonction des photorécepteurs [17], le rôle de Dlx5 dans le couplage ostéoblaste-ostéoclaste [18], et beaucoup d’autres [19-69]. Ses micro kits de quantification de protéines au BCA ont été utilisés pour étudier la localisation immunocytochimique de l’ostéopontine dans la glande de coquille d'œuf aviaire et la coquille [70], pour étudier la récupération après l’impact des blessures corticale contrôlée (CCI) chez le rat [71], et la localisation membranaire de la protéine de core du virus de l’hépatite C et la propagation virale [72]. Le réactif BCA de Sigma BCA [73] et le kit BCA de Bio-Rad étaient également cités.

Thermo Fisher Pierce est aussi un des fournisseurs majeur de kit Bradford. Les kits Coomassie/Bradford de Pierce ont été utilisés pour évaluer l’expression de la protéine chaperonne ERp29 [74], le rôle de YKL-40 dans la modulation de l’activité biologique du facteur de croissance des fibroblastes [75], parmi beaucoup d'autres sujets de recherche, [64, 65, 76-82].

Les réactifs de la méthode de quantification de protéines de Bradford de Bio-Rad ont été cités dans un grand nombre de publications [83-115].

D'autres fournisseurs distribuent les kits Bradford tels que Sigma [116, 117] et Expedeon [118].

Le kit de la méthode de Lowry de Pierce (numéro de catalogue: 23240) a été utilisé pour quantifier la concentration de protéines dans la référence [119] et le kit des laboratoires Bio-Rad a été utilisé dans les références [81] et [82].